Israeli Journal of Pediatrics - אבחון מחלת סיסטיק פיברוזיס ב-2007

סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה אוטוזומלית רצסיבית לטלית, השכיחה ביותר באוכלוסייה הלבנה בעולם (1:2,500 לידות). בישראל השכיחות היא 1:3,300 לידות ביהודים אשכנזים, 1:5,200 לידות בכלל האוכלוסייה היהודית. המחלה נגרמת כתוצאה ממוטציה בגן (CFTR)
Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator שזוהה בשנת 1989. הגן נמצא על הזרוע הארוכה של כרומוזום 7 (7q31.2) ומקודד ליצירת החלבון CFTR, המכיל 1,480 חומצות אמינו (1–3). החלבון נמצא בממברנה האפיקלית של תאי אפיתל במערכת הנשימה, המעי, הלבלב, מערכת הזרע ובלוטות הזיעה, ומתפקד כתעלת כלוריד המאוקטבת על-ידי AMP Cyclic (5,4). מוטציה בגן זה מונעת את ייצור החלבון או מפחיתה אותו או את תפקודו. בסופו של דבר מובילה המוטציה לפגם בהעברת יונים בשכבת האפיתל, ולכן גם לפגם בהעברת מים שבמצב תקין עוברים בעקבות מעבר היונים.
המוטציות של הגן CFTR מסווגות לשש קבוצות (6). I: חוסר ייצור של החלבון, II: פגם בתהליך עיבוד החלבון, III: פגם בבקרת החלבון (Regulation), IV: פגם בתהליך ההולכה (Conductance), V: כמות קטנה של חלבון פעיל, VI: ייצור של חלבון פעיל אך לא יציב (קבוצות I, II, III ,VI: מוטציות שגורמות למחלה קשה, קבוצות IV ,V: מוטציות שגורמות למחלה קלה). המוטציה השכיחה ביותר בקרב אוכלוסיית העולם היא ΔF508, אולם ביהודים אשכנזים המוטציה W1282X היא השכיחה ביותר.
תיאור המחלה כולל אבחון בגיל מוקדם מאוד על-ידי הופעת סממנים קליניים קלאסיים (לרוב רב-מערכתיים, כגון: Meconium Ileus, דלקות ריאה חוזרות, אי ספיקת לבלב, אי-פוריות בגברים), מבחן זיעה לא תקין ו/או נוכחות של מוטציות בגן CFTR על שני האללים. אולם מאז גילוי הגן היה ברור שישנה הטרוגניות גדולה בסממנים הקליניים של המחלה (8,7). מחד, יש מצבים שבהם סממני המחלה הם קלאסיים אך הפרוגנוזה לא טובה. מאידך, לחלק מהחולים יש סממנים "קלים" או לא-קלאסיים של המחלה, אך נמצאו אצלם מוטציות על שני האללים. במחלת CF לא-קלאסית (Non Classic CF), החולים ברובם עם תפקוד לבלב מספיק (PS) ומחלת הריאות שלהם קלה. כאשר מזהים אצלם שתי מוטציות, לפחות אחת מוגדרת כמוטציה "קלה" (Mild). כמו כן תמונה לא-קלאסית של המחלה יכולה להתבטא בפגיעה באיבר אחד (Single Organ Disease) ומבחן הזיעה תקין או גבולי. פגיעה אפשרית יכולה להיות אחת מאלה:
Isolated Obstructive Azoospermia or Chronic Pancreatitis or Allergic Bronchopulmonary Aspergillosis or Disseminated Bronchiolitis or Diffuse Panbronchiolitis or Sclerosing Cholangitis or Neonatal Hypertrypsinogenemia (8).
במצב שכזה, אישור האבחנה של CF נעשה על-ידי גילוי מוטציות בגן (כיום ידועות יותר מ-1,200 מוטציות הגורמות למחלה (9), אך עדיין לא זוהו כל המוטציות. ביהודים אשכנזים יודעים 95% מהמוטציות, אך ביהודים לא אשכנזים וכן בערביי הארץ יודעים הרבה פחות) או הערכה של רמת תפקוד חלבון ה-CFTR על-ידי מדידות אלקטרופיזיולוגיות (11,10) (תמונה 1). בעיות קליניות רבות מתאימות לאבחנה של CF, מכיוון שמחלה רב-מערכתית זו הטרוגנית מאוד, ולעתים הסימפטומים הקליניים לא-קלאסיים (12,7) (טבלה 1).
בחולים עם סימפטומים קליניים קלאסיים, הבדיקות השונות נועדו רק לאשר את האבחנה, אולם בחולים עם מחלת CF
לא-קלאסית, הבדיקות הכרחיות כדי לתמוך באבחנה של CF או לשלול אותה, ואולי לחשוב על אבחנה אחרת. האבחנה של CF היא קלינית אמנם, אך האלגוריתם המוצע (תמונה 1) יכול לסייע במקרים לא-קלאסיים של המחלה. חולים עם מבחן זיעה מעל mmol/L 60 ופנוטיפ קליני המתאים ל-CF מאובחנים כחולי CF קלאסיים. האזור האפור באלגוריתם מייצג בדיקות שניתן לבצען, אך לא הכרחי. מכיוון שאבחנה של CF קריטית ומשפיעה על חיי החולה, רצוי מאוד לבצע בדיקה גנטית גם כאשר מבחן הזיעה פתולוגי. הסבירות ל-CF קלושה ביותר, כאשר מבחן הזיעה נמוך מ-30mmol/L, אולם מבחן זיעה בערך של mmol/L 60–30 מצריך ביצוע בדיקות נוספות בשאלה של אבחנת CF. האלגוריתם יכול למנוע בדיקות מיותרות ולחסוך משאבים וזמן. כתוצאה מכך אבחנה טובה הנעשית בזמן עשויה להוביל לטיפול טוב יותר בחולה.
קיימים שני מדדים אלקטרו-פיזיולוגיים המסייעים באבחון CF, כאשר הסממנים לא-קלאסיים:
א. מדידת הפרש פוטנציאל חשמלי ברירית האף
(Nasal Potential Difference, NPD)
ב. מדידת זרם בביופסיה רקטלית
(Intestinal Current Measurement, ICM).
בדיקות ייחודיות אלו מבוצעות במרכזים ספורים בארצות-הברית ובאירופה, ובארץ אך ורק במעבדה לאלקטרופיזיולוגיה בהדסה הר הצופים.
מדידת NPD היא בדיקה אלקטרופיזיולוגית הנחשבת כקריטריון אבחנתי ל-CF החל משנת 1998 (10). הפרש הפוטנציאל הטרנס-אפיתלי ברירית האף נקבע על-ידי מדידת הפרש הפוטנציאל (מתח) בין צינורית הנמצאת מתחת ל-Inferior turbinate בקדמת האף לבין מחט הנמצאת בתמיסה של רינגר לקטט + 4% אגר

ומוזרקת לחלל התת-עורי מעל כף יד שמאל. הצינורית והמחט מחוברות על-ידי אלקטרודות קלומל אל מגבר בעל התנגדות נמוכה. הצינורית מוכנסת לאף ,בעזרת אוטוסקופ, והמתח נמדד באתרים שונים באף (תמונה 2). לאחר השגת מתח בסיסי קבוע בעל ערך שלילי (הנמדד ביחידות של mV), נמדדת השפעה של הזלפת תמיסת Amiloride (למשך 3 דקות) על המתח. תמיסה זו מעכבת את תעלת הנתרן האפיקלית (ENaC) ובעקבות כך מקטינה מאוד את זרם הנתרן אל תוך התא. פעולה זו גורמת לכך שהמתח הבסיסי נעשה חיובי יותר בהשוואה לערכו ההתחלתי. לאחר מכן מזליפים (למשך 3 דקות) תמיסה נטולת יוני כלוריד (המכילה Amiloride) כדי ליצור מפל ריכוזים שיעודד הפרשה של יוני כלוריד בעיקר דרך תעלת ה-CFTR. מיד לאחר מכן מזליפים (למשך 3 דקות) תמיסה זהה לאחרונה בתוספת Isoproterenol. חומר זה הוא אגוניסט לרצפטור b, הגורם בסופו של דבר לעלייה בריכוז ה-cAMP התוך-תאי. עלייה זו גורמת לאקטיבציה של תעלת ה-CFTR (שהיא תלוית cAMP) ולהפרשה של יוני כלוריד מהתא. בתום 6 הדקות האחרונות (לאחר הזלפת תמיסות
Cl– free + Isoproterenol) המתח חוזר להיות שלילי, קרוב לערך הבסיסי ההתחלתי, ובכך מהווה מדד למעבר אפיקלי של כלוריד. התמיסה האחרונה היא ATP (למשך דקה). חומר זה מעודד הפרשת כלוריד מתעלות כלוריד אלטרנטיביות (שאינן CFTR). עד כה תוארה תוצאת המדידה של נבדק בריא (תמונה 3). עבור חולה CF מתקבלת תוצאה אופיינית (תמונה 4) השונה כמובן מהתוצאה של נבדק בריא:

.
המתח הבסיסי ההתחלתי עבור חולה CF שלילי יותר. שינוי זה יכול להיות מוסבר על-ידי פעילות יתר של תעלת הנתרן האפיקלית (ENaC).
2. לאחר הזלפת Amiloride הופך המתח חיובי יותר מהר יותר. גם שוני זה יכול להיות מוסבר על-ידי פעילות יתר של תעלת הנתרן האפיקלית (ENaC).
3. חוסר שינוי או שינוי מינימלי במתח בתגובה לתמיסות Cl– free + Isoproterenol בחולי CF. מאחר שתעלת CFTR פגומה, כמעט אין הפרשה של יוני כלוריד, ולכן אין שינוי במתח. קריטריון זה נחשב לאינפורמטי ביותר באבחנה של חולי CF.
4. תמיסת ATP משפעלת תעלות כלוריד אלטרנטיביות וגורמת בדרך-כלל לשינוי גדול יותר במתח (המתח נעשה שלילי יותר) בחולי CF בהשוואה לבריאים.
חשוב לציין שבדיקה זו בלתי פולשנית, אך נדרש שיתוף פעולה מצד הנבדק, ולכן היא ניתנת לביצוע מגיל 6 ומעלה. אולם פרויקט ביצוע הבדיקה בילודים ייצא לדרך בקרוב. נוסף על כך לא ניתן לבצע את הבדיקה כאשר קיימת פגיעה בשלמות אפיתל הרירית, כמו זיהום בדרכי הנשימה העליונות, נזלת אלרגית, טראומה לרירית כמו ניתוח או המטומה, ואפילו עישון (13). בדיקה זו נמצאת בסל הבריאות וניתן לקבל התחייבות מקופות החולים השונות.

מדידת זרם בביופסיה רקטלית (ICM) היא כלי אלקטרופיזיולוגי נוסף שיכול לסייע באבחון CF.
בבדיקה זו נעשה שימוש בטכניקת ה-Ussing Chamber – מערכת תאי דיפוזיה הבודקת מעבר חומרים ברקמה חיה (14). רקמת ביופסיה רקטלית ממוקמת בין שני תאים (Chambers) המלאים בתמיסת בופר, מחוממים לטמפרטורה של 37º צלזיוס, ומקבלים אספקה של חמצן וכן גלוקוז רק בתחילת המדידה על מנת לשמור על ה-viability של הרקמה. התאים מחוברים לאלקטרודות מסוג Calomel Reference Electrode, המודדות מתח, ומגבר (Pre-amplifier). כמו כן בחלקו האחורי של כל תא קיים חיבור לאלקטרודות פלטינה, אלקטרודות המודדות זרם, שמחוברות גם הן למגבר (Pre-amplifier) (15). מתח הרקמה מקובע ל-mV 0 ונמדד זרם באופן רציף בתגובה להוספת חומרים המאקטבים או מעכבים תעלות מסוימות. המדידה נמשכת כשעה וחצי.
שלוש תגובות קובעות אם הבדיקה תקינה או לא (מסומנות בעיגול בתמונות 5 ו-6):
1.    התגובה ל-Carbachol היא תגובה חולפת המורכבת מזרם כלוריד וזרם אשלגן. חומר זה גורם לעלייה בריכוז הסידן התוך-תאי. עלייה זו גורמת בסופו של דבר לזרם כלוריד אפיקלי דרך תעלת CFTR ודרך תעלות כלוריד שאינן CFTR (הנחסמות על-ידי DIDS) וכן לזרם אשלגן אפיקלי.
2.    ל-Histamine פעילות דומה לזו של ה-Carbachol. לאחר קבלת תגובה ל-Carbachol נחסמות תעלות כלוריד שאינן CFTR
על-ידי אינקובציה של רקמת הביופסיה עם תמיסת DIDS למשך 10 דקות. הוספת Histamine (לאחר DIDS) בודקת האם יש זרם כלוריד כלשהו דרך ה-CFTR.
3.    התמיסות cAMP+forskolin גורמות לאקטיבציה של תעלת ה-CFTR ולזרם כלוריד אם התעלה מתפקדת.
בנבדק בריא (תמונה 5) תעלת CFTR מתפקדת באופן תקין, ולכן בתגובה ל-Carbachol ול-Histamine מתקבל זרם טרזיאנטי (חולף) חיובי. זרם זה כולל שני מרכיבים: זרם כלוריד (בכיוון החיובי) וזרם אשלגן (בכיוון השלילי), אך התגובה הנראית חיובית, מכיוון שזרם הכלוריד גדול בהרבה מזרם האשלגן וממסך אותו. לאחר הוספת cAMP+forskolin, התגובה המתקבלת היא עלייה בזרם כלוריד עד למצב של פלאטו.
אולם בחולה CF (תמונה 6) תעלת ה-CFTR לא מתפקדת ומתקבל זרם הפוך (שלילי) בתגובה ל-Carbachol ול-Histamine. זרם זה הוא בעצם זרם אשלגן ללא זרם כלוריד. אין שינוי בזרם לאחר הוספת cAMP+forskolin, מאחר שתעלת ה-CFTR אינה מתפקדת.
בשיטה זו ניתן גם לזהות זרם כלוריד מסוים (Residual Chloride Secretion) שיכול להופיע אצל חולי CF לא-קלאסיים או אצל נבדקים עם חשד ל-CF בעזרת שימוש בחסם DIDS, שכאמור חוסם תעלות כלוריד שאינן CFTR.
בתום תגובת הרקמה ל-Carbachol מוסיפים את החומר DIDS למשך 10 דקות, על מנת לבדוק אם יש זרם כלוריד כלשהו שרגיש ל-DIDS. הוספת Histamine כעבור 10 דקות תגרום לתגובה שתעיד על נוכחותו או על היעדרו של זרם כלוריד אפיקלי כלשהו דרך ה-CFTR .
בדיקה זו ישימה עבור ילדים מיום היוולדם, מאחר שלא נדרש שיתוף פעולה מצידם כמו בבדיקת NPD. תהליך לקיחת הביופסיה קצר, פשוט ואינו מלווה בכאב. מיד לאחר לקיחתה, נבדקת הביופסיה במעבדה במערכת שהיא ex vivo.
בדיקות אלו נועדו בעיקר עבור מקרים לא-קלאסיים של מחלת (17,16) CF .
האבחנה של CF לרוב ברורה: התמונה הקלינית קלאסית למחלה, והאבחנה הקלינית נתמכת על-ידי מבחן זיעה פתולוגי ומוטציות. אולם אבחון מקרים לא-קלאסיים של ילדים ומתבגרים הוא אתגר גדול עבור הרופאים.

References
1.    Rommens JM, Iannuzzi MC, Kerem B, Drumm ML, Melmer G, Dean M,
Rozmahel R, Cole JL, Kennedy D, Hidaka N, Zsiga M, Buchwald M,
Riordan JR, Tusi L-C, Collins FS. Identification of the cystic fibrosis gene: Chromosomes walking and jumping. Science 1989;245:1059-1065
2.    Riordan JR, Rommens JM, Kerem B, Alon N, Rozmahel R, Grzelczak Z,
Zielenski J, Lok S, Plavsic N, Chou JL, Drumm ML, Iannuzzi MC, Collins FS, Tusi L-C. Identification of the cystic fibrosis gene: Clonning and characterization of complementary DNA. Science 1989;245:1066-1073
3.    Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A, Buchwald M, Tusi L-C. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science 1989;245:1073-1080
4.    Anderson MP, Rich DP, Gregory RJ, Smith AE, Welsh MJ. Generation of cAMP-activated chloride currents by expression of CFTR. Science 1991;251:679-682
5.    Bear CE, Li C, Kartner N, Bridges RJ, Jensen TJ, Ramjeesingh M, Riordan JR. Purification and functional reconstitution of the cystic fibosis transemembrane conductance regulator (CFTR). Cell 1992;68:809-818
6.    Zielenski J. Genotype and phenotype in Cystis Fibrosis. Respiration
2000;67(2):117-133
7.    Orenstein BM, Winnie GB, Altman H. Cystic fibrosis: a 2002 update. J Pediatr 2002;140:156-164
8.    World Health Organisation. Classification of cystic fibrosis and related disorders. Report of a joint working group of WHO/ICF(M)A/ECFS/ECFTN, 2001 (Reprinted in J Cyst Fibros 2002;1:5-8)
9.    http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/
10.    Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement. J Ped 1998;132:589-595
11.    Veeze HJ, Sinaasappel M, Bijman J, Bouquet J, De Jonge HR. Ion transport abnormalities in rectal suction biopsies from children with cystic fibrosis. Gastroenterology 1991;101:398-403
12.    Boyle MP. Nonclassic cystic fibrosis and CFTR-related diseases. Curr Opin Pulm Med 2003;9:498-503
13.    Cantin AM, Hanrahan JM, Bilodeau G, Ellis L, Dupuis A, Liao J, Zielenski J, Durie P. Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator function is suppressed in cigarette smokers. Am J Respi Crit Care Med 2006;173:1139-1144
14.    Ussing HH, Zerahn K. Active transport of sodium as the source of the electrical current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiol Scand 1951;23:110-127
15.    De Jonge HR, Ballmann M, Veeze H, Bronsveld I, Stanke F, Tummler B,
Sinaasappel M. Ex vivo CF diagnosis by intestinal current measurement (ICM) in small aperture, circulating Ussing chambers. Journal of Cystic Fibrosis 2004;3:159-163
16.    Wilschanski M, Famini H, Strauss-Liviatan N, Rivlin J, Blau H,
Bibi H, et al. Nasal potential difference measurements in patients with atypical cystic fibrosis. Eur Respir J 2001;17:1208-1215
17.    Yaakov Y, Stern G, Shoseyov D, Bentur L, Goldberg S, Shchar E, Kerem E, Wilschanski M. Intestinal current measurement as a diagnostic aid in cystic fibrosis in infants and young children. Ped Pulm 2006;29:290