אבחון טרום-לידתי
אבחון טרום-לידתי לא חודרני באמצעות אנליזה של חומצות גרעין בדגימות פלזמה של האם – סקירה
ד"ר ברוך פלדמן
רופא בכיר במכון הגנטי ובאגף נשים ויולדות; המרכז הרפואי ע"ש ח' שיבא, תל השומר
המאמר סוקר את המצב הקיים ואת השינויים שצפויים להיות בעתיד הקרוב ביכולת הטכנית לזהות הפרעות גנטיות שכיחות בבדיקת חומצות גרעין עובריות בדגימות פלזמה של האם במהלך ההיריון.
רקע
רוב המערכות הקליניות העוסקות באבחון טרום-לידתי מכוונות לזהות אנומליות כרומוזומליות ומחלות תורשתיות שכיחות בעובר. מבחני סקר קיימים לשני סוגי המחלות הגנטיות העיקריות: מבחני סקר לאיתור אנומליות כרומוזומליות, בייחוד תסמונת דאון, מבוססים על גיל האם, על מבחנים ביוכימיים בדגימות סרום של האם ועל פרמטרים אולטרה-סוניים בבדיקות דימות של העובר; בדיקות סקר למחלות תורשתיות מבוססות על היסטוריה משפחתית ועל איתור נשאים של מוטציות, הגורמות למחלות תורשתיות שכיחות באוכלוסייה מסוימת.
תוצאות מבחני הסקר מזהות את העוברים הנמצאים בסיכון גבוה להיות נגועים במחלות הגנטיות השכיחות, אך קביעת אבחנה ייחודית לעובר מסוים אפשרית אך ורק בבדיקה פרטנית של החומר הגנטי שלו. משמעות הדבר שאבחון גנטי טרום-לידתי תלוי באופן מוחלט בהשגת דגימה ביולוגית של העובר.
טכנולוגיה אמינה ופשוטה יחסית להשגת דגימה מהחומר הגנטי של עובר במהלך ההיריון קיימת כבר מאמצע המאה הקודמת. דיקור מי שפיר, דגימת סיסי שליה ודיקור חבל הטבור הן שלוש שיטות מבוססות להשגת חומר גנטי של העובר ובדיקתו בשיטות מעבדה שאמינותן מצוינת. בדיקת קריוטיפ של העובר ואיתור מוטציות בשיטות מולקולריות פשוטות מאפשרים זיהוי כמעט ודאי של עוברים נגועים באנומליות כרומוזומליות שכיחות ובמחלות תורשתיות מסוימות.
הקושי העיקרי בהשגת דגימה של העובר במהלך ההיריון נובע מהצורך לבצע פעולה חודרנית, הכרוכה בסיכון משמעותי לבריאות האם והעובר. לפיכך מושקע מאמץ ניכר בעשרים השנים האחרונות בפיתוח שיטות בטוחות להשגת חומר גנטי של העובר ללא צורך בפעולה חודרנית.
התגלית החשובה הראשונה בעניין זה הייתה התצפית שבמחזור הדם האמהי יש תאים עובריים. הממצא עורר תקווה גדולה שזיהוי התאים ובידודם יספק מקור טוב ואמין לבדיקת החומר הגנטי של העובר. עבודת מחקר עצומה נעשתה בכיוון זה, אך יישום קליני עדיין לא מתאפשר, וכנראה לא יתאפשר גם בעתיד הקרוב משתי סיבות עיקריות:
1. כמות התאים העובריים במחזור הדם האמהי קטנה ביותר;
2. התאים העובריים נשארים לעתים קרובות במחזור הדם האמהי עד כמה שנים לאחר סיום ההיריון.
קבוצת המחקר של כותבי הסקירה הנוכחית דיווחה ב-1997 כי בפלזמה האמהית יש דנ"א חופשי של העובר. החוקרים הראו כי ניתן לזהות, בשיטות מולקולריות פשוטות, דנ"א של העובר בדגימות פלזמה של האם. תצפיות חוזרות הראו כי דנ"א חופשי ממקור עוברי מופיע בדגימות פלזמה של האם בתוך זמן קצר (שבועות בודדים) מתחילת ההיריון, ונעלם ממחזור הדם האמהי בתוך כמה שעות ממועד הלידה. יתר על כן, הכמות היחסית של דנ"א חופשי ממקור עוברי אינה מבוטלת, ושיעורה הוא כ-10% מכמות הדנ"א החופשי בדגימות פלזמה של האם במהלך ההיריון. תצפיות אלה פתחו חלון נוסף לתקווה כי נמצא מקור טוב להשגת חומר גנטי של העובר בשיטות לא חודרניות.
זיהוי רצפים ייחודיים לעובר בדגימת פלזמה אמהית
הקושי העיקרי ביישום שיטות אבחון קליניות על בסיס זה הוא הצורך לוודא באופן מוחלט כי הבדיקה מבוצעת על חומר גנטי של העובר, אף שהדגימה "מזוהמת" בדנ"א אמהי. הגישה הקלינית הראשונה בנויה על זיהוי רצפים של חומצות גרעין שמקורם יכול להיות אך ורק ממקור עוברי. כלומר, זיהוי שלהם קובע בוודאות מוחלטת שמקורם בעובר.
אנליזה של רצפים ייחודיים לכרומוזום Y
זיהוי של רצפי דנ"א ייחודיים לכרומוזום Y מאפשר לקבוע כי מקורם בעובר. יתר על כן, זיהוי חיובי של רצפים כאלה או אי-זיהוי שלהם מאפשר לקבוע את מין העובר. קבוצות שונות יישמו את הרעיון הזה לכדי מבחן קליני רגיש (>95%) לקביעת מין העובר במהלך השבועות הראשונים להיריון.
קביעת סוג דם RH של העובר
פרט בעל סוג דם רזוס חיובי נושא לפחות אלל אחד של RhD. פרט שהוא רזוס שלילי אינו נושא אלל RhD כלל. לפיכך זיהוי או אי-זיהוי של רצף אופייני לאלל RhD בדנ"א חופשי בדגימת פלזמה של אם שהיא רזוס שלילי מאפשר לקבוע בוודאות את סוג הדם של העובר. ברור כי יש לכך חשיבות רבה בניהול היריון, שבו יש לאם נוגדנים מכוונים לאנטיגן D. המודל הזה חשוב במיוחד ליישום תוכנית אבחון טרום-לידתי לא חודרני, משום שדיקור מי שפיר או דגימת סיסי שליה לקביעת גנוטיפ של העובר בנסיבות אלה מסכנת את ההיריון בריגוש נוסף של מערכת החיסון האמהית.
מרקרים אוניברסליים של דנ"א עוברי
פולימורפיזם אבהי כביקורת חיובית
אי-זיהוי של רצפים אופייניים לכרומוזום Y או לגן RhD בבדיקת דנ"א עוברי בדגימת פלזמה של האם קובע אבחנה של עובר ממין נקבה או עובר שהוא רזוס שלילי. אבחון על דרך השלילה עלול להוביל, במקרים מסוימים, לאבחון שגוי, בעיקר משום שגם כשל טכני במהלך הבדיקה, כמו כישלון לרכז דנ"א או פירוק טבעי שלו, עלולים לגרום לתוצאה דומה. שימוש בביקורת חיובית ימנע במידה רבה תוצאה שלילית שגויה. הוכח כי זיהוי רצפים יחודיים לדנ"א אבהי יכול לשמש כביקורת חיובית אמינה. סמנים פולימורפיים, שבהם יש להורים אללים שונים, יכולים, ואכן משמשים, כלים יעילים להוכחה כי יש בדגימה דנ"א עוברי, ומשמשים חיזוק משמעותי לאבחנה על דרך השלילה במקרים אלה.
חתימה אפיגנטית של השליה כביקורת חיובית
סמנים פולימורפיים יכולים לשמש כביקורת חיובית אמינה, אך השימוש בהם דורש התאמת סמנים אינפורמטיביים לכל משפחה, כלומר, הקמת מערכת ייחודית לכל היריון. כדי להימנע מהצורך הזה, תכננו חוקרים מערכת ביקורת חיובית אוניברסלית המבוססת על העובדה, שבכל רקמה מופעלים ומושתקים גנים שונים. אחת הדרכים השכיחות ביותר להפעלה או לדיכוי של ביטוי גנים היא מתילציה של נוקלאוטידים מסוימים (CpG) באזורי הבקרה של הגן, ולכן היפו- או היפר-מתילציה של גנים מסוימים מאפיינת במידה רבה את המקור הרקמתי של דגימת הדנ"א הנבדקת. דגימת פלזמה של האם מכילה דנ"א חופשי, שמקורו בתאי דם אמהיים ודנ"א עוברי שמקורו בשליה. הוכח כי רמת המתילציה על הרצף של הגן SerpinB5 תלויה במקור הרקמתי של הרצף. בדגימת דנ"א שמקורה בשליה יהיה הגן בהיפו-מתילציה, ואילו רצף הגן שמקורו בתאי דם של האם יהיה בהיפר-מתילציה. ברור מכאן כי רמת מתילציה נמוכה של הגן משמשת הוכחה חיובית לנוכחות של דנ"א עוברי בדגימת פלזמה של האם. דוגמה אחרת היא רמת המתילציה של רצף הגן RassF1. רצף הנוקלאוטידים של הגן הזה נמצא בהיפר-מתילציה כאשר הוא ממקור שלייתי, ובהיפומתילציה בדנ"א שמקורו בתאי דם של האם.
החוקרים הוכיחו גם כי רמת המתילציה של דנ"א בפלזמה של האם חוזרת לנורמה זמן קצר ביותר לאחר הלידה. משמעות תצפיות אלה ברורה. קביעת אבחנה של עובר ממין נקבה או עובר בעל סוג דם Rh שלילי מקבלת חיזוק משמעותי ביותר כאשר באותה דגימת פלזמה של האם נמדדה היפו-מתילציה של SerpinB5 או היפר-מתילציה של רצף הגן EassF1. מדידה זו אינה תלויה בהכנה מוקדמת, ולכן היא פשוטה ומתאימה לכל הנבדקים.
אבחון פרה-נטלי לא חודרני של מחלות תורשתיות מונוגניות
אבחון של מחלות מונוגניות של העובר בדגימות פלזמה של האם התמקד בתחילת הדרך במחלות דומיננטיות המורשות מהאב. זיהוי מוטציה "אבהית" בדגימה זו אישר את האבחנה שהעובר לוקה במחלה זו. אבחון של מחלות אוטוזומליות רצסיביות או של מחלות דומיננטיות שעוברות בתורשה מהאם נתקל בקושי ניכר, משום שאין אפשרות פשוטה להבדיל בין מוטציה שמקורה בדנ"א עוברי לבין זו שמקורה בדנ"א של האם.
שיטה אחת להתגבר על בעיה זו באבחון של מחלה אוטוזומלית רצסיבית היא זיהוי האלל הנורמלי של האב באמצעות סמנים פולימורפיים. נוכחות אלל נורמלי של האב תבטיח שהעובר יהיה נשא של המוטציה האמהית לכל היותר.
שיטה אחרת לאבחון של מחלה אוטוזומלית רצסיבית מתייחסת להורים שנושאים מוטציה זהה. שיטה דיגיטלית מיוחדת של PCR מאפשרת לכמת את מספר האללים הנושאים מוטציה, ולהשוות אותם למספר האללים שנושאים דנ"א נורמלי בדגימת פלזמה של האם. לדוגמה: דגימת פלזמה מאם הטרוזיגוטית למוטציה הנושאת עובר שגם הוא הטרוזיגוט (נשא) למוטציה, תכיל מספר שווה של אללים תקינים ואללים מוטנטיים. לעומת זאת, דגימת פלזמה מאם הטרוזיגוטית הנושאת עובר הומוזיגוט למוטציה (כלומר חולה), תכיל יותר אללים מוטנטיים מאללים תקינים, ודגימה מעובר בריא שאינו נושא אללים מוטנטיים כלל תכיל פחות אללים מוטנטיים בהשוואה לאללים תקינים.
שיטה זו של קביעת הכמות היחסית של אללים מוטנטיים לעומת אללים תקינים בדגימת פלזמה של האם מאפשרת גם אבחון פרה-נטלי של מחלות דומיננטיות המורשות מהאם, ובוודאי גם מחלות אוטוזומליות רצסיביות, שבהן יש לשני ההורים מוטציות שונות.
אבחון פרה-נטלי לא חודרני של אנומליות כרומוזומיות
אבחון של אנאופלואידיה, כמו למשל תסמונת דאון, היא אחת האינדיקציות השכיחות ביותר לאבחון פרה-נטלי חודרני. שני מכשולים עיקריים מקשים מאוד על אבחון של אנומליות כרומוזומיות בדנ"א חופשי של העובר בדגימת פלזמה של האם: קושי אחד נובע מקריאות הרקע של דנ"א אמהי, המצוי בדגימה בכמות גדולה. הקושי השני נעוץ בעובדה כי דנ"א חופשי אינו מאורגן בכרומוזומים, ולכן קשה לקבוע את מספרם בדרך פשוטה.
זיהוי רצפי דנ"א ייחודיים לעובר
בדומה למתואר לעיל בסעיף 2ג, ניתן לאתר רצפי דנ"א ייחודיים לשליה, ולהשתמש באלה המצויים על הכרומוזום, שאת כמותו יש עניין מיוחד לקבוע באבחון טרום-לידתי. למשל, הגן PLAC4, המצוי על כרומוזום 21, או הגן SerpinB2, המצוי על כרומוזום 18. מקורם של שני הגנים (משליה או מתאי דם אמהיים) ניתן לזיהוי ברור בדגימת פלזמה של האם על פי רמת המתילציה או על פי ביטוי mRNA שלהם.
את מספר הכרומוזומים במטען הגנטי של העובר ניתן לקבוע על ידי היחס בין כמות האללים השונים של הרצף הנבדק, שמקורו נקבע להיות בשליה. בדגימת דנ"א של עובר הלוקה בתסמונת דאון, למשל, יהיה אלל אחד של הגן PLAC4 כפול בכמותו מהאלל השני. בעובר תקין, לעומת זאת, שבו יש שני כרומוזומי 21, תהיה הכמות היחסית של שני האללים שווה. תוכנית כזאת תלויה כמובן בנוכחות של אתר פולימורפי ברצף הנבדק, ולכן לא תתאים באופן גורף לכל היריון.
שיטה אפשרית אחרת היא למדוד את כמות הרצף הייחודי לשליה הנמצא על הכרומוזום הנבדק, ולהשוות אותו לרצף אחר ממקור עוברי שכמותו צפויה להיות תקינה. למשל, רצף ייחודי לכרומוזום Y בעוברים ממין זכר.
ספירת רצפים על כרומוזום 21
Digital-PCR ו- Massively-Parallel-Sequencingהן טכנולוגיות חדשות המאפשרות ספירה של מולקולות בודדות. רמת הדיוק של השיטות האלה מאפשרת לקבוע בדיוק נמרץ ביותר את מספר המולקולות של רצף ייחודי מסוים בדגימת פלזמה של האם. אפשר, למשל, לספור את כלל המולקולות (ממקור אמהי ועוברי ביחד) של רצף ייחודי לכרומוזום 21, ולהשוות אותו למספר המולקולות של רצף הנמצא על כרומוזום אחר. בדגימת פלזמה של אישה הרה, שעוברה לוקה בתסמונת דאון, יהיו יותר רצפים השייכים לכרומוזום 21 בהשוואה לרצף הנמצא על כרומוזום אחר.
ריצוף כמותי (Next Generation Sequencing) היא טכנולוגיה חדשה, המאפשרת ריצוף של מיליונים עד ביליונים של מולקולות דנ"א בכל הרצה. השיטה מאפשרת, לפיכך, זיהוי מהיר ויעיל של כל רצפי ה-דנ"א הנמצאים בדגימת פלזמה, והשייכים לכרומוזום מסוים. החוקרים הראו כי בשיטה זו ניתן לכמת את כל הרצפים השייכים לכרומוזום 21, ולקבוע אם לעובר הנבדק יש או אין טריזומיה 21 על ידי השוואת כמות הרצפים האלה לכמות הרצפים בדגימה מעובר תקין.
שימוש קליני באבחון טרום-לידתי בלתי-חודרני בדגימות פלזמה של האם – המצב הקיים
עברו כמעט 15 שנה מאז שגילו כי במחזור הדם האמהי יש דנ"א חופשי ממקור עוברי. אבחון של מין העובר ושל סוג דם רזוס שלו עברו את המבחן הקליני, והם משמשים לאבחון גנטי לא חודרני בכמה מעבדות בעולם (גם בישראל). פרוטוקולים לאישור האבחנה באמצעות זיהוי רצפים ייחודיים לעובר בדגימת פלזמה של האם נכנסים ממש בימים אלה לשלבי הכנה סופיים, והם ישמשו במעבדות הקליניות בקרוב מאוד.
השיטות לאבחון מחלות מונוגניות ואנאופלואידיה של העובר בדגימת פלזמה של האם נמצאות בפיתוח מואץ. המגבלות הטכניות ניתנות, קרוב לוודאי, לפתרון זמין. הקשיים העיקריים המונעים את יישומן והטמעתן של שיטות אלה במערכות קליניות הם עלות גבוהה והתאמת השיטות לעבודת מעבדה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה.
שיטות אלה תהיינה, לדעת כותבי הסקירה, זמינות, ולמעשה תחלפנה את השיטות הקיימות במהלך העשור הקרוב.
דיון
השיטות המתוארות במאמר סקירה זה מעוררות את הדמיון ופותחות פתח למה שצופן לנו העתיד הקרוב, גם ללא כל קשר לאבחון טרום-לידתי.
עם זאת, קשה למי שעוסק באבחון טרום-לידתי להאמין כי המאמץ האדיר המושקע בפיתוח שיטות אלה נועד אך ורק כדי "להימנע מדיקור מי שפיר". השגת דגימה ביולוגית של העובר בשיטות חודרניות היא כל כך פשוטה, זמינה ופטורה לחלוטין מכל הקשיים הטכניים הכרוכים בשימוש בדגימה המכילה, בכל מקרה ובכמות גדולה, גם תוצרי רקמה אמהית. הסיבוכים המיילדותיים של דיקור מי שפיר או של דגימת סיסי שליה אינם אפסיים, אך שיעורם נמוך במידה שמעוררת שאלה אמתית על הצורך הקיים בפיתוח השיטות הנהדרות האלה ובהשקעה האדירה הנדרשת כדי להפוך אותן לשיטות קליניות, אמינות וזמינות לשימוש רחב של ציבור גדול.
יתר על כן, נראה כי העתיד הקרוב מזמן התקדמות אדירה ביכולת הטכנית שלנו לאבחן כמעט כל מצב חולי הקשור בחומר הגנטי, גם בעוברים במהלך ההיריון. השיטות הקיימות לאבחון טרום-לידתי "לא חודרני" אינן מאפשרות בינתיים אפילו את הבדיקות הפשוטות ביותר הקיימות היום. סביר להניח כי בעוד כמה שנים, כאשר שיטות אלה יאפשרו אבחון זמין, יעיל ובטוח של אנומליות כרומוזומיות ושל מחלות מונוגניות של העובר, לא נוכל להסתפק בכך.
קבצים מצורפים:
|